Diplômée du Conservatoire d’art dramatique de Québec en 1984, Guylaine Tremblay passe les 5 années suivantes à jouer sur toutes les scènes de Québec dans plus de 40 productions théâtrales.

En 1991, elle décide de poursuivre sa carrière à Montréal, où elle commence sa collaboration avec le Nouveau Théâtre expérimental de Robert Gravel, en plus de rejoindre les rangs de la LNI. On peut découvrir son talent exceptionnel dans les productions théâtrales les plus diverses : Lion dans les rues, Durocher le milliardaire, Matroni et moi, Albertine en 5 temps, C’était avant la guerre à L’Anse-à-Gilles, 24 poses, Les voisins, Là, Ça se joue à deux, Belles-sœurs, Encore une fois, si vous permettez, Enfant insignifiant, et en 2021 dans la pièce Les étés souterrains, son premier solo au théâtre, qui a été diffusée également en direct à Télé-Québec.

À la télévision, en 1993, elle incarne le rôle de Caro dans La petite vie, qui la fait connaître du grand public. Par la suite, les rôles se succèdent : Quatre et demi…, Histoires de filles, Emma, Annie et ses hommes, Les rescapés, En tout cas, Unité 9, Anna et Arnaud, sans oublier sa participation, depuis 2019, au Bye bye, l'émission de fin d’année diffusée à la télévision nationale.

Au cinéma, elle a la chance de rencontrer la réalisatrice Catherine Martin (Mariage et Trois temps après la mort d’Anna) et le réalisateur Bernard Émond (20 h 17 rue Darling et Contre toute espérance).

Guylaine Tremblay touche également à l’animation dans le magazine social Banc public, pour lequel elle reçoit le prix Gémeaux de la meilleure animation en 2019, et à l’enseignement, en 2022, à Star académie, comme professeure d’interprétation.